科学論文紹介

CRISPR-Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells ~新たなゲノム編集ツール~

コチさんによるイラストACからのイラスト

CRISPR-Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells
https://www.nature.com/articles/s41467-019-13226-x

ゲノム編集技術といえばCRISPR-Cas9システムがまず思い浮かびますが、最近、Cas9以外のCasヌクレアーゼを持ちいたゲノム編集が色々と報告されています (特許戦争、、、)。
今回、Cas3を使ったゲノム編集が報告されていて興味深かったのでメモ。ちなみに、偶然にも、Cas3を含むType I-EのCRISPRシステムについてレポートを書いたことがあったので、この記事の最後に張り付けてあります。

Cas3はCas9とは違い、複数の蛋白質が複合体を作って機能します。Cas3、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas11の6種類もの蛋白質が必要なので(Fig. 1a & 1d) 、それだけで機能するCas9に比べて少し使いづらそうですね。

Cas3はN末端にHD-nuclease domain (標的DNAの1本鎖になった部分を切断)とC末端にSF2-helicase domain (3’ to 5’ の向きに標的DNAをほどく)をもっています。標的DNAの分解には両方のドメインが必要みたいです(Fig. 1g)。

Cas9を用いたゲノム編集では、標的DNAにindelと呼ばれる小さな欠失や挿入が導入冷ますが、面白いことに、Cas3を用いたゲノム編集では、標的DNAの上流に100 bpから100 kbpとかなり大きな欠失が生じるようです (Fig. 2bなど)。Cas3が持つhelicase活性が効いている模様。標的DNAの上流に欠失が生じるのがみそで、標的DNAには傷が入らないので、繰り返し認識され、欠失のサイズが拡大していくのではと考察されていました。

ゲノム編集効率はCas9が圧倒的っぽいですが(そもそもCas9の活性が高すぎなんですね)、off-target (Fig. 3)や、最後、デュシェンヌ型筋ジストロフィー症患者由来のiPS細胞で治療検討まで行われていました(Fig. 4)。

せっかく色々なCasによるゲノム編集が報告されているので、有効利用して研究を進めていきたいですね。

おまけ
[レポート: 細菌の免疫機構] 免疫システムを駆使して感染から身を守るのは高等動物の専売特許ではない。細菌もファージ感染から身を守るべく進化してきた。例えば、制限酵素や不稔感染は細菌の感染防御システムとして古くから知られている。これは非特異な防御という点で「自然免疫」に近しいと言える。では、細菌は「獲得免疫」も有しているのか。答えはYESである。細菌ゲノムに存在するCRIPSR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 領域は特異性・記憶性を兼ね備えた獲得免疫を細菌にもたらす。このCRISPR領域はspacerと呼ばれる配列を間に有するpalindromeのrepeatという特徴的な構成をしている。その近傍にはCRIPSRの免疫システムに関わるCas (CRISPR associated proteins)遺伝子をコードする領域も存在する。このレポートではTypeⅠ-E (E. coli)のCRISPRシステムを3つの段階 (Adaptation・ Processing・Interference) に分けて説明することで、細菌の獲得免疫機構の全体像を掴むことを目的とする。

a. Adaptation. CRISPRによる獲得免疫は、ファージの遺伝情報の一部をspacerとして取り込むことから始まる。このspacerの取り込みにはNaïveとprimedの2つの様式が存在する。前者はCRISPR領域内にファージの情報が存在しない場合、つまり初感染の場合である。一方、後者は情報を記憶したファージの再感染の場合で、interferenceと関連して同じ遺伝情報の取り込みにポジティブフィードバックがかかり、免疫が強化される。両者いずれの場合にしてtargetとなる配列(protospacer)の近傍にはPAMと呼ばれる一定のモチーフが必要である。これにより自身のCRISPR領域内に取り込んだspacerをtargetとしてしまうことを回避できる。認識されたtarget配列は不要な部分を切り取られた後、spacerとして取り込まれる。詳細な機構はまだ明らかになっていないが、Cas1-Cas2複合体がspacerの運搬と挿入を担っていると推測されている。
b. Processing. CRISPR領域の上流にはleader配列が存在し、ここを起点に転写が始まる。そうなると当然、転写産物であるpre-CRISPR RNAはいくつものrepeatとspacerを有しており、成熟型のcrRNAになるためにprocessingを経る必要がある。前述のとおり、CRISPR領域内のrepeat配列はpalindromeになっているため、転写産物はいくつものhairpinを形成している。このhairpin構造がCas6eによって認識・切断されることで、spacerとhairpin構造を1つ有する成熟型となる。
c. Interference. CRISPRによる免疫システムの最終段階は、target配列の分解による、ファージ遺伝情報の破壊である。processingにより生成されたcrRNAはCas6eを含むCascadeタンパク質と複合体を作ってtargetを認識する。Adaptationの場合と同様、隣接するPAMモチーフが必要である。この複合体自体には切断活性はないが、Cas3 nuclease/helicaseをリクルートすることで、targetを切断することが可能となる。

参考文献: Rath, D., Amlinger, L., Rath, A. & Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochimie 117, 119–128 (2015).